CONTENIDO Módulo 1 Separación de componentes celulares y diagnóstico serológico ...... 15 Introducción ................................................................................................. 16 Capítulo 1 El laboratorio en la clínica ....................................................................... 17 1.1. Objetivos ............................................................................................... 17 1.2. Reacciones de precipitación ................................................................. 17 1.2.1. Inmunodifusión simple ................................................................. 17 1.2.2. Inmunodifusión doble tipo I .......................................................... 17 1.2.3. Inmunodifusión doble tipo II ........................................................ 18 1.2.4. Inmunodifusión radial simple........................................................ 18 1.3. Inmunoelectroforesis ............................................................................ 18 1.4. Aglutinación .......................................................................................... 18 1.4.1. Aglutinación directa ..................................................................... 19 1.4.2. Aglutinación indirecta (pasiva) ..................................................... 19 1.4.3. Aglutinación reversa .................................................................... 19 1.4.4. Hemoaglutinación ........................................................................ 19 1.5. Inmunofluorescencia ............................................................................. 19 1.5.1. Inmunofluorescencia directa........................................................ 20 1.5.2. Inmunofluorescencia indirecta ..................................................... 20 1.6. Análisis de inmunoabsorción unida a enzimas (ELISA) ....................... 20 1.7. Pruebas de fijación del complemento ................................................... 20 1.8. Perfil inmunológico ............................................................................... 21 1.8.1. Exámenes de un perfil inmunológico ........................................... 21 1.8.2. Procedimiento .............................................................................. 21 1.9. Cuestionario .......................................................................................... 23 Capítulo 2 Preparación de diluciones y determinación cuantitativa de leucocitos .... 23 2.1. Objetivos ............................................................................................... 23 2.2. Materiales ............................................................................................. 23 2.3. Procedimiento ....................................................................................... 23 2.3.1. Condiciones para tomar una muestra de sangre......................... 23 2.3.2. Condición de las muestras de suero para pruebas inmunológicas .... 24 2.3.3. Inactivación ................................................................................ 24 2.3.4. Preparación de concentraciones ................................................. 25 2.3.4.1. Ejercicios ....................................................................... 25 2.3.5. Cámara cuenta células ............................................................... 25 2.3.6. Ensayo de recuento de leucocitos .............................................. 26 2.4. Cuestionario .......................................................................................... 28 2.5. Informe de laboratorio .......................................................................... 28 2.5.1. Resultados .................................................................................. 28 2.5.2. Discusión de resultados .............................................................. 29 2.5.3. Conclusiones ............................................................................... 29 Capítulo 3 Órganos linfoides ...................................................................................... 30 3.1. Introducción .......................................................................................... 30 3.1.1. Órganos linfoides primarios ........................................................ 30 3.1.2. El timo ......................................................................................... 30 3.1.3. Médula ósea ............................................................................... 31 3.1.4. Órganos linfoides secundarios .................................................... 31 3.2. Objetivos ............................................................................................... 31 3.3. Materiales ............................................................................................. 31 3.4. Procedimiento ....................................................................................... 32 3.5. Órganos linfoides .................................................................................. 37 3.6. Cuestionario .......................................................................................... 37 3.7. Informe de laboratorio .......................................................................... 38 3.7.1. Resultados .................................................................................. 38 3.7.2. Discusión de resultados .............................................................. 38 3.7.3. Conclusiones ............................................................................... 38 Capítulo 4 Suspensiones celulares de timo, bazo y ganglios linfáticos ............... 39 4.1. Separación de poblaciones de linfocitos................................................ 39 4.2. Objetivos ............................................................................................... 39 4.3. Materiales ............................................................................................. 39 4.4. Procedimiento ....................................................................................... 40 4.4.1. Suspensiones ............................................................................... 40 4.4.2. Suspensión de timo ..................................................................... 40 4.4.3. Suspensión de bazo ..................................................................... 45 4.4.4. Conteo de células ....................................................................... 46 4.4.5. Determinación de viabilidad........................................................ 46 4.5. Cuestionario .......................................................................................... 46 4.6. Informe de laboratorio .......................................................................... 47 4.6.1. Resultados .......................................................................................... 47 4.6.2. Discusión de resultados ..................................................................... 47 4.6.3. Conclusiones ...................................................................................... 47 Capítulo 5 Fagocitosis ................................................................................................. 48 5.1. Introducción .......................................................................................... 48 5.2. Objetivos ............................................................................................... 49 5.3. Materiales ............................................................................................. 49 5.4. Procedimiento ....................................................................................... 48 5.4.1. Observación de neutrófilos ......................................................... 50 5.4.2. Diferenciación del proceso fagocítico ........................................ 50 5.5. Informe práctico ................................................................................... 51 5.6. Informe de laboratorio .......................................................................... 52 5.6.1. Resultados .................................................................................. 52 5.6.2. Discusión de resultados .............................................................. 52 5.6.3. Conclusiones ............................................................................... 53 Capítulo 6 Separación de linfocitos T ....................................................................... 54 6.1. Introducción .......................................................................................... 54 6.1.1. Separación de linfocitos en gradiente de densidad en Ficoll Isopaque ........................................................................... 54 6.1.2. Aislamiento de subpoblaciones linfocitarias: formación de rosetas .. 55 6.1.3. Aislamiento de subpoblaciones linfocitarias: separación en placa .... 55 6.1.4. Técnica de Elispot ...................................................................... 56 6.1.5. Prueba de estimulación de linfocitos........................................... 56 6.2. Objetivos ............................................................................................... 57 6.3. Materiales ............................................................................................. 57 6.4. Métodos ................................................................................................ 57 6.5. Cuestionario .......................................................................................... 58 6.6. Informe de laboratorio .......................................................................... 58 6.6.1. Resultados .................................................................................. 58 6.6.2. Discusión de resultados .............................................................. 59 6.6.3. Conclusiones ............................................................................... 59 Capítulo 7 Técnica de inmunodifusión radial ........................................................... 60 7.1. Introducción .......................................................................................... 60 7.1.1. Alteración en la concentración de algunas proteínas séricas y su relación con algunas patologías ........................................... 60 7.2. Objetivo ................................................................................................. 61 7.3. Procedimiento ....................................................................................... 61 7.4. Cuestionario .......................................................................................... 61 7.5. Informe de laboratorio .......................................................................... 62 7.5.1. Resultados .................................................................................. 62 7.5.2. Discusión de resultados .............................................................. 63 7.5.3. Conclusiones ............................................................................... 63 Capítulo 8 Inmunofluorescencia ................................................................................ 64 8.1. Introducción .......................................................................................... 64 8.2. Objetivo ................................................................................................. 64 8.3. Materiales ............................................................................................. 64 8.4. Reactivos .............................................................................................. 64 8.5. Procedimiento ....................................................................................... 65 8.6. Cuestionario .......................................................................................... 65 8.7. Informe de laboratorio .......................................................................... 67 8.7.1. Resultados .................................................................................. 67 8.7.2. Discusión de resultados .............................................................. 67 8.7.3. Conclusiones ............................................................................... 67 Capítulo 9 ELISA (enzimoinmunoanálisis) .............................................................. 68 9.1. Introducción .......................................................................................... 68 9.2. Objetivos ............................................................................................... 68 9.3. Materiales ............................................................................................. 68 9.4. Procedimiento ....................................................................................... 69 9.5. Cuestionario .......................................................................................... 71 9.6. Informe de laboratorio .......................................................................... 73 9.6.1. Resultados .................................................................................. 73 9.6.2. Discusión de resultados .............................................................. 73 9.6.3. Conclusiones ............................................................................... 74 Talleres de interpretación diagnóstica .......................................................... 74 Taller 1 ......................................................................................................... 74 Taller 2 ......................................................................................................... 76 Capítulo 10 Electroforesis de proteínas ..................................................................... 78 10.1. Introducción ........................................................................................ 78 10.1.1. Principios de la electroforesis .................................................. 78 10.2. Objetivos ............................................................................................. 79 10.3. Técnica ............................................................................................... 79 10.4. Procedimiento ..................................................................................... 79 10.5. Electroforesis en agarosa ................................................................... 80 10.6. Cuestionario ........................................................................................ 80 10.7. Informe de laboratorio ........................................................................ 81 10.7.1. Resultados ............................................................................... 81 10.7.2. Discusión de resultados ........................................................... 82 10.7.3. Conclusiones ............................................................................ 82 Bibliografía Módulo 1 .............................................................................. 83 Libros de consulta ................................................................................. 83 Textos para las clases prácticas ........................................................... 83 Glosario ................................................................................................. 84 Lista de siglas y acrónimos ................................................................... 85 Normas de bioseguridad ....................................................................... 86 Módulo 2 Ensayo de inmunización con péptidos inmunogénicos de Toxoplasma gondii como herramienta terapéutica y ayuda diagnóstica ................................................................................................. 87 Introducción ................................................................................................. 88 Objetivos ...................................................................................................... 90 General .................................................................................................. 90 Específicos ............................................................................................. 90 Justificación ................................................................................................. 90 Impacto esperado ........................................................................................ 91 Marco teórico ............................................................................................ 92 1.1. Toxoplasmosis ....................................................................................... 92 1.2. Taxonomía ............................................................................................. 92 1.3. Estructura básica y ciclo de vida .......................................................... 92 1.3.1. Taquizoitos .................................................................................. 93 1.3.2. Bradyzoitos y quistes tisulares .................................................... 101 1.3.2.1. Estado enteroepitelial ..................................................... 104 1.3.3. Oocisto........................................................................................ 106 1.4. Respuesta inmune ................................................................................. 107 1.4.1. Inmunidad mediada por linfocitos T ............................................ 107 1.4.2. Papel de los macrógafos y las células NK ................................. 108 1.4.3. Activación temprana de LT ........................................................ 109 1.4.3.1. Modulación de la activación de linfocito T ..................... 109 1.4.3.2. Regulación de las citoquinas ........................................... 110 1.4.4. Mecanismos efectores del INFg en la infección por Toxoplasma gondii .................................................................... 110 1.4.4.1. Estructura y función del interferón g ............................. 110 1.4.5. Papel del IFNg en la infección por Toxoplasma gondii. Aportes del estudio de la respuesta inmune en el modelo murino .... 1113 1.4.5.1. Mecanismos efectores del IFNg durante la infección por Toxoplasma gondii. Diferencias entre macrófagos murinos y humanos ....................................................... 113 1.4.5.2. Nuevo mecanismo efector del INFg ............................. 115 Diseño metodológico ............................................................................... 118 2.1. Materiales y métodos ............................................................................ 118 2.1.1. Tipo de estudio y población ......................................................... 118 2.1.2. Criterios de selección ................................................................. 119 2.2. Técnicas de secuenciación y síntesis de péptido .................................. 119 2.2.1. Unión del primer aminoácido ...................................................... 119 2.2.2. Desprotección y neutralización ................................................... 119 2.2.3. Acople del siguiente aminoácido ................................................. 120 2.2.4. Desprotección y clivaje con HF del péptido con resina .............. 120 2.2.5. Extracción y liofilización ............................................................. 120 2.2.6. Oxidación .................................................................................... 120 2.2.7. Diálisis del péptido ...................................................................... 120 2.2.8. Marcaje y almacenamiento del péptido ...................................... 120 2.3. Selección del modelo animal e inoculación de los péptidos ................... 121 2.3.1. Reto con los péptidos .................................................................. 121 2.3.2. Sangrías ...................................................................................... 121 2.3.3. Reto con los parásitos ................................................................. 121 Variables ..................................................................................................... 122 3.1. Definición de variables ......................................................................... 122 3.3.1. Variables independientes ............................................................. 122 3.3.2. Variables controladas .................................................................. 122 Bibliografía Módulo 2 .............................................................................. 124 Glosario ................................................................................................. 129 Lista de siglas y acrónimos ................................................................... 130