Doctorado en Ciencias Biomédicas y Biológicas
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Examinando Doctorado en Ciencias Biomédicas y Biológicas por Director "Ramírez, Juan David"
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- ÍtemAcceso AbiertoDeterminación del microbioma intestinal en pacientes con infección por clostridioides difficile adquirida en unidad de cuidados intensivos y comunidad(2023-05-15) Herrera Ossa, Giovanny Andrés; Ramírez González, Juan David; Muñoz Díaz, Claudia Marina; Grupo de Investigaciones Microbiológicas UR (GIMUR)Clostridioides difficile (CD), es considerada como la principal causa de diarrea asociada al uso de antibióticos, la cual se asocia a una desregulación de la microbiota intestinal del hospedero, que afecta a los diferentes componentes de la microbiota, siendo el bacteriano el más ampliamente estudioado. Sin embargo, otros grupos de organismos, cómo virus y eucariotas, se han descrito como miembros fundamentales dentro del ecosistema intestinal, e incluso se destaca la función de loci clínicamente importantes, especialmente aquellos asociados con resistencia a antibióticos. A pesar de la gran relevancia de los miembros de la microbiota intestinal sobre la homeóstasis de dicho ecosistema, poco se conoce sobre su papel en el ámbito de la ICD, así como la influencia del lugar de adquisición de la diarrea sobre la composición (diversidad y abundancia) del microbioma, en especial en el contexto de las enfermedades inflamatorias intestinales. Por estas razones, este estudio se dirigió a determinar la composición del microbioma intestinal de pacientes con diarrea asociada a la ICD, adquirida en Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) y en comunidad, a través de la implementación de técnicas de secuenciación de alto rendimiento. Para esto, se seleccionaron 98 muestras de ADN provenientes de pacientes con diarrea adquirida en comunidad y a nivel intrahospitalario, tanto positivos como negativos para ICD, las cuales fueron sometidas a secuenciación de marcador único ARNr-16S y -18S. Posteriormente, se seleccionaron 48 muestras de este grupo inicial y fueron sometidas a secuenciación metagenómica. Inicialmente, se observaron cambios en la composición de la microbiota asociada a los grupos de pacientes con diarrea adquirida a nivel intrahospitalario (HCFO/+, HCFO/-) caracterizada por la disminución de microorganismos benéficos, sugiriendo la importancia del lugar de adquisición de la infección sobre la modulación del ecosistema intestinal. Así mismo, se observaron interacciones entre los diferentes miembros de la microbiota intestinal. La secuenciación metagenómica permitió evidenciar un grupo de 51 especies diferencialmente abundantes entre los grupos, con una reducción en los genes implicados en el metabolismo del butirato en los grupos de pacientes con diarrea adquirida a nivel intrahospitalario. Finalmente, se observaron microorganismos productores de acetato y butirato característicos para cada uno de los grupos, con diferencias marcadas tanto en sus abundancias como en sus perfiles de resistencia. Se destaca, además, el papel de los microorganismos asociados al metabolismo del butirato sobre el ecosistema intestinal en el ámbito de la ICD. Por su parte, el estudio de la microbiota de las garrapatas se ha convertido en una herramienta de gran utilidad en la vigilancia y control de las enfermedades transmitidas por garrapatas, las cuales se encuentran ampliamente distribuidas en el continente europeo, siendo un problema de salud pública, con especial énfasis en España, donde regiones como Castilla y León han presentado unas tendencias al aumento en las poblaciones de garrapatas así como en los reportes de picaduras. Por lo anterior, empleando el esquema de análisis para secuenciación profunda de marcador único generado en los apartados anteriores se realizó la descripción de 29 ejemplares de 5 especies de garrapatas duras recolectadas en dicha región encontrando diferencias en la composición taxonómica así como en las correlaciones entre los miembros de su microbiota, siendo este el primer estudio piloto realizado en dicho territorio
- ÍtemAcceso AbiertoDiversidad genética de Blastocystis y Giardia intestinalis en diferentes regiones de Colombia(2020-10-30) higuera-gelvez, adriana-marcela; Ramírez, Juan DavidEn el mundo, Blastocystis ha sido reportado como el microorganismo eucariota más común en el intestino de humanos y animales, con prevalencias incluso hasta del 100%, junto con Giardia intestinalis, quien ha sido considerado el principal agente causal de cuadros diarreicos en humanos, afectando aproximadamente 200 millones de individuos a nivel mundial. En general, el diagnóstico de ambos microorganismos se basa frecuentemente en la observación de formas típicas en heces y solo a nivel de investigación se busca su tipificación por medio del uso de técnicas moleculares. Además, cabe resaltar que, pocos genes han sido utilizados para evaluar sus características a nivel genético y que la mayoría de estudios moleculares se han enfocado únicamente a la tipificación y pocos han incluído la evaluación de la diversidad genética y estructura de poblaciones intra e inter grupos, dejando de lado el estudio de su biología, taxonomía, distribución, potencial zoonótico de transmisión e incluso obtener evidencia que permita esclarecer si su estructura poblacional es de tipo sexual o clonal. En Colombia la situación no es muy diferente a lo reportado en otros países, principalmente aquellos en vía de desarrollo, donde las condiciones comportamentales, socioeconómicas y ambientales favorecen la transmisión de algunas enfermedades intestinales, y, zonas con alta endemicidad propenden por el aumento en la variación genética de estos microorganismos, que, posiblemente, junto con el ambiente de fuerte competencia a nivel intestinal, hacen más factible la ampliación hacia nuevos hospederos y por ende mantienen la transmisión zoonótica, tanto con animales domésticos como silvestres, cumpliendo un papel fundamental en el mantenimiento de los ciclos epidemiológicos y haciendo cada vez más difícil el control y prevención de estas infecciones. Por esta razón, éste estudio buscó, no solamente detectar molecularmente estos microorganismos en diferentes regiones del país, sino también conocer sus genotipos circulantes, realizando un primer acercamiento a la epidemiología molecular de estos parásitos intestinales en las zonas evaluadas, y posteriormente, evaluar la diversidad existente a nivel intra taxa tanto de G. intestinalis como de Blastocystis, por medio del análisis de nuevos blancos genéticos que nos permitieron demostrar una gran variación genética, particularmente relacionada con posibles eventos de intercambio genético en G. intestinalis y variación intra Subtipo (ST) en el caso de Blastocystis. Los resultados producidos por esta tesis permitieron: a) describir una primera aproximación de la frecuencia de cada uno de los microorganismos parasitarios evaluados, como Blastocystis, G. intestinalis, Cryptosporidium y el complejo Entamoeba histolytica/dispar/moshkovskii en cinco regiones biogeográficas de Colombia, sugiriendo que la región del Caribe tiene una mayor frecuencia para cada uno de estos. Además, gracias a los ensamblajes de Giardia, los STs de Blastocystis y especies de Cryptosporidium halladas, 11 mostrar la posible transmisión zoonótica de estos microorganismos hacia los seres humanos en algunas regiones del país, b) mostrar la variabilidad genética presente en G. intestinalis y los eventos de intercambio genético intra e inter ensamblaje, por medio de la evaluación de nueve blancos genéticos y finalmente c) determinar la diversidad genética de Blastocystis y su variación intra subtipo, gracias al uso en conjunto del gen ribosomal 18s y el gen metabólico sdhA. En conclusión, estos resultados muestran la gran necesidad de seguir evaluando las características genéticas de estos microorganismos, primordialmente en Colombia, para lograr establecer intervenciones de control y prevención más efectivas, y más aún, teniendo en cuenta, que la gran diversidad encontrada puede influir directamente en su prevalencia, dinámica de transmisión y virulencia. Quizás, en un futuro cercano, el uso de análisis genómicos de cepas aisladas a partir de muestras colombianas, puedan dar solución a algunos de los vacíos del conocimiento que permanecen en torno a estos microorganismos y sus características biológicas.
- ÍtemAcceso AbiertoGenómica y transcriptómica comparativa de Trypanosoma Cruzi(2021-12-06) Cruz Saavedra, Lissa Briceida; Ramírez, Juan David; Grupo de Investigaciones Microbiológicas UR (GIMUR)El parásito Trypanosoma cruzi es conocido como el agente etiológico de la enfermedad de Chagas, según reportes de la Organización Mundial de la Salud (OMS) se encuentra dentro de las 17 enfermedades tropicales desatendidas y es la tercera infección parasitaria más común en todo el mundo después de la malaria y la esquistosomiasis. T. cruzi muestra una marcada diversidad genética que ha permitido clasificarlo al menos en seis unidades discretas de tipificación (DTUs). Así mismo, una alta variabilidad genética intra-DTU ha sido observada en TcI, la DTU más prevalente en Colombia y altamente distribuida a nivel mundial. Esta variabilidad ha llevado a algunos autores a clasificarla en genotipos, que en algunos casos son asociados a los ciclos eco-epidemiológicos de la transmisión de este parásito. De igual manera, una alta plasticidad genómica ha sido reportada en T. cruzi, reflejada en aneuploidías cromosómicas y re-arreglos estructurales entre los genes codificantes para las familias multigénicas. Sin embargo, y a pesar de los avances en los últimos años en el estudio del genoma de T. cruzi muy pocos estudios han evaluado la arquitectura genómica de este parásito. Por otro lado, este parásito posee un complejo ciclo de vida que transcurre entre humanos, mamíferos-reservorios e insectos triatominos de la subfamilia Reduviidae; presenta varios estadios morfológicos con características antigénicas distintas. Uno de los procesos más importantes durante su ciclo de vida es la metaciclogénesis, cuyo objetivo final es la transformación de epimastigotes replicativos a tripomastigotes metacíclicos infectivos. Durante este proceso se generan cambios morfológicos, metabólicos, transcriptómicos y proteómicos que permiten su progreso y confieren características infectivas al mismo; además de características virulentas de invasión de células y tropismo hacia diferentes tejidos. A pesar de los estudios realizados sobre la metaciclogénesis, el conjunto de cambios que ocurren en el transcriptoma durante este proceso biológico no se ha evaluado a profundidad en T. cruzi. Por otro lado, el ciclo de vida en el mamífero, donde se incluyen los estadios amastigotes y tripomastigotes derivados de células, cobra gran importancia ya que durante el desarrollo de este se pueden llegar a generar las manifestaciones clínicas relacionadas con la enfermedad de Chagas, producida por este parásito, principalmente por la invasión celular, replicación y lisis celular, que adicionalmente desencadena una fuerte respuesta inmune por parte del hospedero que no es efectiva en la eliminación de este, pero si afecta y daña los tejidos en el hospedero, lo que hace aún más interesante el estudio en la expresión génica de T. cruzi en estos estadios. Por los motivos anteriormente expuestos, el objetivo general de este trabajo fue “Evaluar la arquitectura genómica y los perfiles de expresión génica durante el ciclo de vida de Trypanosoma cruzi”, del cual se desencadenan tres objetivos específicos: 1. Describir la arquitectura genómica y diversidad genética de clones de Trypanosoma cruzi I (TcI). 2. Evaluar los perfiles de expresión génica de Trypanosoma cruzi I durante el proceso de metaciclogénesis in vitro. 3. Determinar la remodelación en la expresión génica durante el ciclo de vida de Trypanosoma cruzi II. Siendo cada uno de los anteriores objetivos asociados a un capítulo dentro de este trabajo de tesis. En relación con el primer capítulo de este estudio, se exploró la diversidad genómica entre 18 clones colombianos de T. cruzi I y 15 clones de T. cruzi I de otros países de América. Los resultados obtenidos confirman la alta variabilidad genética descrita con anterioridad a un nivel filogenético, la presencia de una alta heterocigosidad entre los genomas, y la existencia de un clado compatible con el genotipo TcIdom, descrito previamente para cepas asiladas a partir de humanos en Colombia y Venezuela. Adicionalmente, se reportan diferentes procesos compatibles con una alta plasticidad en el genoma de TcI. Eventos de aneuploidía total y segmentaria (SA) presentes a lo largo de los cromosomas con características diferenciales entre cepas e incluso entre clones de la misma cepa fueron encontrados y corroborados por medio de cálculos de la profundidad y la frecuencia alélica. Así mismo, se encontró pérdida de heterocigosidad (LOH) en diferentes cromosomas, la ubicación de los fragmentos que presentaban LOH, al igual que la extensión a lo largo de cada cromosoma, no estuvo relacionada entre los distintos clones aislados de cada cepa. Por último, los genes presentes en los segmentos con SA y LOH fueron evaluados. Los genes relacionados con puntos calientes de retrotransposón (RHS) se encontraron flanqueando el inicio de las secuencias que presentaban SA. Los resultados observados sugieren que la compleja regulación del genoma involucrado en este parásito implica más procesos que otros eucariotas y podría estar involucrada en la respuesta para evitar diferentes tipos de estrés durante el complejo ciclo de vida de este parásito. Para responder el segundo y tercer capítulo de esta tesis, se determinó el momento exacto de obtención de los tripomastigotes metacíclicos realizando curvas de metaciclogénesis en medio LIT y se seleccionó el día donde se presentó una diferencia estadísticamente significativa en el aumento de la producción de estas formas respecto al día cero. Como resultados en general, se logró establecer el día de inicio de la metaciclogénesis para las DTUs TcI y TcII y se estandarizó un protocolo para la producción y purificación de tripomastigotes metacíclicos en cultivo LIT por medio del uso de una cromatografía en resina de sefarosa-DEAE, de igual manera, se comprobó que esta técnica no afecta la capacidad infectiva del parásito de manera in vivo e in vitro. Los resultados obtenidos para el segundo capítulo, relacionados con los perfiles de expresión de T. cruzi I, permitieron determinar que existía una diferencia entre la expresión génica de epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos para la DTU TcI. Además, que una de las principales vías reguladas diferencialmente estaba relacionada con los ribosomas, de los cuales se infiere juegan un papel fundamental durante la regulación génica y mantenimiento del proteoma celular en el proceso de metaciclogénesis; otra vía diferencialmente expresada fue la autofagia, que se sabe participa durante todo el ciclo de vida de T. cruzi y es un estímulo fundamental en la metaciclogénesis, los perfiles energéticos relacionados con la glucosa, el metabolismo de los aminoácidos, y por último, los procesos celulares y de DNA. Para el capítulo 3, se logró determinar que existían diferencias estadísticamente significativas entre todos los estadios presentes en el ciclo de vida de T. cruzi II, siendo importante destacar una clara diferenciación en la expresión génica entre los tripomastigotes derivados de células y los tripomastigotes metacíclicos. Al igual que como se reportó para el capítulo 2, una gran cantidad de genes relacionados con los procesos energéticos de la glucosa, la autofagia y los perfiles de genes codificantes para proteínas ribosomales fue diferencialmente expresado a lo largo del ciclo de vida de TcII demostrando su importancia en el ciclo de vida de este parásito. Sin embargo, de manera interesante este estudio fue capaz de captar la expresión de genes específicos relacionados con meiosis y recombinación homologa SPO11 y RAD51. Los resultados obtenidos abren una ventana de conocimiento para el análisis de diferentes procesos fundamentales en el ciclo de vida de Trypanosoma cruzi¸ e incluso algunos que no habían sido previamente descritos, que podrían aportar al entendimiento de la historia natural y biología de este parásito.
- ÍtemAcceso AbiertoGenómica y transcriptómica comparativa en cepas de Leishmania de Colombia(2019-09-26) Patiño, Luz H.; Pavia Velandia, Paula XimenaLa Leishmaniasis es una enfermedad tropical ocasionada por parásitos protozoarios del género Leishmania. En Colombia esta enfermedad representa un grave problema de salud pública debido al elevado número de casos reportados anualmente, la cantidad de especies encontradas y la aparición de cepas resistentes, principalmente frente a los medicamentos de primera línea: antimoniato N-metil glucamina (Glucantime®). Hasta el momento, varios estudios utilizando técnicas de secuenciación de última generación y basados en herramientas como las “omicas” han proporcionado información crucial con respecto a los mecanismos de resistencia y adaptación utilizados por estos parásitos frente a los antimoniales. Sin embargo, este conocimiento en especies de Leishmania del nuevo mundo son escasos, así como estudios que permitan describir la arquitectura genómica intra-especifica en estas especies. Teniendo en cuenta lo anterior, este estudio evaluó el comportamiento genómico y transcriptómico de las principales especies de Leishmania que circulan en Colombia bajo la presión al N-metil glucamina (Glucantime® (SbIII), así como la arquitectura genómica de estas especies, obtenidas a partir de aislamientos clínicos. Los resultados producto de esta tesis permitieron describir que (i) la distribución de las especies de Leishmania a nivel urbano/selvático es diferente, (ii) los cambios genómicos y transcriptómicos en respuesta a los antimoniales trivalentes es una característica compartida entre especies del viejo y del nuevo mundo y (iii) describir la baja variación estructural encontrada en Leishmania braziliensis y Leishmania panamensis. Finalmente, consideramos que estudios adicionales son necesarios con el propósito de seguir ampliando el conocimiento acerca de los mecanismos de adaptación de este parásito.