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Development of novel molecular assays for the identification of histoplasma capsulatum: targeting protein-coding genes and RRNA
Título de la revista
Autores
Escobar-Díaz, Fabio A
Agudelo-Calderón, Carlos A
Fecha
2013-04
Directores
ISSN de la revista
Título del volumen
Editor
Asociación Colombiana de Infectología
Elsevier
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Resumen
Objetivo: El objetivo principal de esta colaboración internacional es desarrollar y validar nuevos métodos moleculares para el diagnóstico rápido de histoplasmosis y para el seguimiento de los pacientes durante la terapia. Material y métodos: para obtener una base de datos representativa de la secuencia de H. capsulatum, extrajimos ADN de 30 cultivos de referencia de este patógeno fúngico que correspondía a ocho de los clados previamente reportados, y amplificamos secuencias conocidas de cuatro loci: los genes que codifican los 100 La proteína kDa y los antígenos H y M, todos específicos para H. capsulatum, y los espaciadores transcritos internos (ITS) entre los genes de rRNA. Todos los productos de PCR se secuenciaron y editaron utilizando Se-quencher 5.0. Para diseñar cebadores y sondas específicos para identificar H. capsulatum mediante PCR cuantitativa (qPCR), alineamos todas las secuencias obtenidas para cada locus diana usando MEGA 5. Resultados: Se estandarizaron diez protocolos de amplificación de qPCR y se evaluaron usando ADN de los cultivos de H. capsulatum. , así como el ADN extraído de otros 37 patógenos médicamente relevantes. Todos los ensayos de PCR bajo evaluación fueron positivos cuando se realizaron con ADN purificado de los diversos cultivos de levadura H. capsulatum, las secuencias amplificadas exhibieron un 100% de identidad con las secuencias de referencia para este hongo, y ninguno de los ADN obtenidos de cultivos de los otros microorganismos dio positivo resultados. Conclusiones: estos ensayos podrían ser útiles en nuestra búsqueda para desarrollar un ensayo qPCR para la detección de H. capsulatum en muestras humanas
Abstract
Objective: The primary objective of this international collaboration is to develop and validate new molecular methods for the rapid diagnosis of histoplasmosis and for the follow up of patients during therapy. Material and methods: In order to obtain a representative H. capsulatum sequence database, we extracted DNA from 30 reference cultures of this fungal pathogen that corresponded to eight of the clades previously reported, and amplified known sequences of four loci: the genes encoding the 100 kDa protein and the H and M antigens, all specific for H. capsulatum, and the internal transcribed spacers (ITS) between the rRNA genes. All PCR products were sequenced and edited using Se-quencher 5.0. To design specific primers and probes for identifying H. capsulatum by quantitative PCR (qPCR), we aligned all sequences obtained for each target locus using MEGA 5. Results: Ten qPCR protocols for amplification were standardized and evaluated using DNA from the H. capsulatum cultures, as well as DNA extracted from 37 other medically relevant pathogens. All PCR assays under evaluation were positive when performed with purified DNA from the various H. capsulatum yeast cultures, the amplified sequences exhibited 100% identity to the reference sequences for this fungus, and none of the DNAs obtained from cultures of the other microorganisms gave positive results. Conclusions: These assays could be useful in our quest to develop a qPCR assay for the detection of H. capsulatum in human samples
Palabras clave
Diagnosis , Ensayos clínicos , Histoplasmosis
Keywords
Diagnosis , Clinical trials , Histoplasmosis
