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Análisis del metagenoma y viroma del linaje tropical de la garrapata Rhipicephalus sanguineus sensu lato (s.l.) en los departamentos de Santander y Casanare en Colombia


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Fecha
2023-11-27

Directores
Ramírez González, Juan David
Muñoz Díaz, Claudia Marina

ISSN de la revista
Título del volumen
Editor
Universidad del Rosario

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Resumen
Las garrapatas, reconocidas como vectores de gran relevancia a nivel mundial, se distinguen por su capacidad de transmitir una amplia gama de patógenos a diferentes especies de vertebrados. Entre estas garrapatas, se destaca Rhipicephalus sanguineus sensu lato (s.l.), conocida como la garrapata marrón de perro, que se considera de gran importancia tanto para la salud animal como humana. R. sanguineus s.l es una especie monotrópica, endófila y de tres hospederos, siendo notable por su amplia distribución global. Esta garrapata tiene la capacidad de transmitir diversos patógenos, ya sea como vectores mecánicos o biológicos, incluyendo bacterias, protozoos, hongos, nematodos y virus. Sin embargo, no son los únicos microorganismos significativos que conforman la microbiota de las garrapatas. En total, se pueden identificar tres comunidades ecológicas, tanto en el interior como en el exterior de R. sanguineus s.l. De esta manera, la microbiota de la garrapata está compuesta por patógenos transmitidos por ellas (causantes de enfermedades en humanos y animales), comensales y endosimbiontes. Estos últimos pueden aportar diversos beneficios a la garrapata, lo que incide en su aptitud biológica y, por lo tanto, en su abundancia. Para identificar estos microorganismos, en particular aquellos patógenos transmitidos por garrapatas, se han empleado múltiples metodologías. Esto incluye métodos tradicionales como el análisis microscópico, el cultivo y la amplificación de genes, junto con la secuenciación Sanger. No obstante, estos métodos tienen limitaciones, como su falta de sensibilidad y especificidad para un solo patógeno. Recientemente, la metagenómica mediante el enfoque de shotgun metagenomics ha ampliado estas técnicas, lo que permite identificar múltiples patógenos al mismo tiempo y también detectar otras comunidades ecológicas relevantes, como los endosimbiontes. Esta técnica se ha utilizado ampliamente para caracterizar el viroma de garrapatas, incluyendo R. sanguineus s.l, utilizando su ARN. A pesar de las ventajas que ofrece el shotgun metagenomics, este no ha sido aplicado en Rhipicephalus sanguineus s.l en Colombia, a pesar de su importancia como vector de enfermedades para la salud humana y animal en todo el mundo. Esta garrapata provoca impactos directos e indirectos en varios hospederos, incluyendo a algunos de gran relevancia económica, como el ganado, donde se destaca la transmisión de una diversidad de patógenos. Esta situación se agrava en Colombia, donde la mayoría de los patógenos identificados se han detectado mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), lo que limita la amplificación a un número reducido de patógenos y no permite conocer el amplio espectro de patógenos que R. sanguineus s.l puede albergar. Esto conlleva a una falta de comprensión de los efectos que esta garrapata puede estar generando en animales domésticos y seres humanos en el país, especialmente en lo que respecta a posibles enfermedades de relevancia médica y veterinaria que podrían estar transmitiéndose. Esto incluye enfermedades como la fiebre manchada de las Montañas Rocosas, causada por R. rickettsia, la anaplasmosis granulocítica humana, causada por A. phagocytophilum, la enfermedad de Lyme producida por B. burgdorferi, y la babesiosis canina, principalmente causada por B. vogeli en Colombia. Debido a la falta general de conocimiento sobre esta garrapata en Colombia, así como su impacto en la transmisión de enfermedades y su diversidad de hospederos potenciales, surge la pregunta central: ¿Qué comunidades de microorganismos se pueden identificar en R. sanguineus s.l?. La realización de esta investigación nos permitió detectar organismos patógenos que circulan en el país a través de esta garrapata, contribuir al conocimiento general sobre los endosimbiontes y, sobre todo, avanzar en la comprensión del microbioma de R. sanguineus s.l. Considerando lo mencionado anteriormente, el objetivo general de este estudio fue analizar el metagenoma del linaje tropical de la garrapata Rhipicephalus sanguineus sensu lato (s.l.) en las regiones de Boyacá y Casanare en Colombia. Este objetivo se desglosa en dos objetivos específicos: 1. Describir la composición de las comunidades microbianas de ADN presentes en R. sanguineus s.l. mediante un enfoque metagenómico. 2. Analizar la composición de los virus de ARN presentes en R. sanguineus s.l. a través de la evaluación del viroma utilizando secuenciación con la tecnología de Oxford Nanopore. Cada uno de estos objetivos específicos corresponde a un capítulo independiente dentro de la tesis. En el primer capítulo de la tesis, se llevó a cabo una extracción de ADN de las garrapatas, que posteriormente se sometió a secuenciación por Novoseq 6000 de Illumina, con una capacidad de 6 gigabytes por muestra. Para el análisis bioinformático, se emplearon dos aproximaciones: una asignación directa de las secuencias (reads) y la generación de ensamblajes metagenómicos (MAGs). A través de estas técnicas, se identificaron microorganismos, incluyendo endosimbiontes y patógenos. Entre los microorganismos identificados, los tres más abundantes en términos relativos fueron Anaplasma phagocytophilum, Francisella tularensis y Theileria equi. Además, se logró la identificación de endosimbiontes pertenecientes a los generos Coxiella, Rickettsia y Wolbachia. En particular, se logró ensamblar MAGs para la especie Coxiella mudrowiae, lo que permitió realizar análisis de genómica comparativa y funcional. Además, se exploraron las correlaciones entre los diversos microorganismos identificados, destacando que C. mudrowiae presentaba correlaciones negativas con otros endosimbiontes y patógenos. En el segundo capítulo de la tesis, se realizó la extracción de ARN de las muestras, seguida de un proceso de eliminación de ARN de hospederos mediante el tratamiento RiboZero y un enriquecimiento viral mediante SMART9N. La secuenciación se llevó a cabo utilizando el dispositivo MinION de Oxford Nanopore. Se siguió un enfoque similar al del primer capítulo, asignando directamente las secuencias y generando MAGs para el conjunto de muestras, manteniendo restricciones geográficas y de sexos. Como resultado de esta investigación, se identificaron seis virus diferentes que conforman el viroma de esta especie de garrapata. Estos virus incluyen una especie similar al virus Flavi asociado a Rhipicephalus, el virus Mogiana de la garrapata, un virus de la familia Iflaviridae, el virus Jingmen de la garrapata, Bole tick virus 4 y Mivirus sp. Para dos de estos virus, se logró un ensamblaje exitoso, lo que permitió llevar a cabo análisis filogenéticos y comparativos basados en genomas disponibles de diferentes regiones del mundo.
Abstract
Ticks, globally recognized as vectors of paramount significance, are characterized by their capacity to transmit an extensive array of pathogens to diverse vertebrate species. Among these ticks, Rhipicephalus sanguineus sensu lato (s.l.), known as the brown dog tick, holds a position of great importance in both animal and human health. R. sanguineus s.l. is a monophyletic, endophilic, three-host tick species, notable for its widespread global distribution. This tick species can act as a vector for various pathogens, serving as mechanical or biological transmitters of bacteria, protozoa, fungi, nematodes, and viruses. However, ticks do not operate in isolation; they harbor a complex microbiota comprising pathogens transmitted by them, commensals, and endosymbionts. These endosymbionts can offer a range of advantages to ticks, influencing their biological fitness and, consequently, their population dynamics. To identify these microorganisms, particularly those transmitted by ticks, various methodologies have been employed. These encompass conventional techniques such as microscopic analysis, culture, and gene amplification by PCR, combined with Sanger sequencing. However, these methods have limitations, including their inability to provide sensitivity and specificity for individual pathogens. In recent times, metagenomics, specifically the shotgun metagenomics approach, has expanded the scope of these techniques. It enables the simultaneous identification of multiple pathogens and the detection of other ecologically significant communities, such as endosymbionts. Despite the potential advantages of shotgun metagenomics, it has not yet been applied to Rhipicephalus sanguineus s.l. in Colombia, despite its critical role as a disease vector for both human and animal health on a global scale. This tick species has direct and indirect impacts on various hosts, including economically significant ones such as livestock, where it transmits a diverse range of pathogens. In Colombia, the situation is further exacerbated, as the majority of identified pathogens have been detected using the polymerase chain reaction (PCR) technique. PCR is limited in its capacity to amplify only a small number of pathogens, thereby failing to provide insight into the full spectrum of pathogens that R. sanguineus s.l. may carry. Consequently, this knowledge gap impedes our understanding of the potential effects this tick species may be having on domestic animals and humans in the country, particularly in relation to medical and veterinary relevant diseases. These diseases include Rocky Mountain spotted fever, caused by R. rickettsia, human granulocytic anaplasmosis, caused by A. phagocytophilum, Lyme disease caused by B. burgdorferi, and canine babesiosis, primarily caused by B. vogeli. Given the overall lack of knowledge about this tick species in Colombia, as well as its impact on disease transmission and its wide range of potential hosts, the central question arises: What communities of microorganisms can be identified in R. sanguineus s.l.? Conducting this research enabled us to detect circulating pathogenic organisms within the country via this tick and contribute to a better understanding of endosymbionts. Most importantly, it advanced our comprehension of the microbiome of R. sanguineus s.l., laying the foundation for future strategies to control tick-borne diseases based on microbiome modifications. In light of the above, the overarching objective of this study was to analyze the metagenome of the tropical lineage of the tick Rhipicephalus sanguineus sensu lato (s.l.) in the regions of Boyacá and Casanare in Colombia. This objective is further detailed through two specific aims: 1. Describe the composition of DNA microbial communities in R. sanguineus s.l. using a metagenomic approach. 2. Analyze the composition of RNA viruses in R. sanguineus s.l. through virome assessment using Oxford Nanopore sequencing technology. Each of these specific objectives corresponds to a distinct chapter within the thesis. In the first chapter of the thesis, DNA was extracted from ticks, which was subsequently subjected to Illumina's Novoseq 6000 sequencing platform, capable of handling 6 gigabytes per sample. For the bioinformatic analysis, two approaches were used: direct sequence assignment and metagenomic assembly (MAGs). Through these techniques, microorganisms were identified, including endosymbionts and pathogens. Among the microorganisms identified, the three most abundant in relative terms were Anaplasma phagocytophilum, Francisella tularensis, and Theileria equi. Additionally, endosymbionts belonging to the Coxiella, Rickettsia, and Wolbachia genera were identified. Notably, MAGs were successfully assembled for the species Coxiella mudrowiae, enabling comparative and functional genomics analysis. Furthermore, correlations between the various microorganisms identified were explored, with particular emphasis on the negative correlations observed between C. mudrowiae and other endosymbionts and pathogens. In the second chapter of the thesis, RNA was extracted from the samples, followed by the elimination of host RNA using RiboZero treatment and viral enrichment via SMART9N. Sequencing was carried out using Oxford Nanopore's MinION device. A similar approach to the first chapter was followed, including direct sequence assignment and the generation of MAGs for the complete set of samples, all while maintaining geographical and gender-specific restrictions. As a result of this research, six different viruses constituting the virome of this tick species were identified. These viruses include a species closely related to the Rhipicephalus-associated Flavi virus, the tick Mogiana virus, a virus from the Iflaviridae family, the tick Jingmen virus, Bole tick virus 4, Mivirus sp. Successful assembly of two of these viruses facilitated phylogenetic and comparative analyses based on available genomes from various regions around the world.
Palabras clave
Rhipicephalus sanguineus sensu lato , Metagenomica , Garrapata , Viroma , Patógenos , Endosimbiontes
Keywords
Rhipicephalus sanguineus sensu lato , Metagenomics , Tick , Virome , Patogens , Endosimbionts
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