Doctorado en Ciencias Biomédicas

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    Functional studies of the deubiquitinating enzymes USP19, USP4 and UCH-L1
    (2013-12-02) Velasco Pinto, Kelly Marcela; Lindsten, Kristina; Masucci, Maria Grazia; Camacho Navarro, María Marcela
    El marcaje de proteínas con ubiquitina, conocido como ubiquitinación, cumple diferentes funciones que incluyen la regulación de varios procesos celulares, tales como: la degradación de proteínas por medio del proteosoma, la reparación del ADN, la señalización mediada por receptores de membrana, y la endocitosis, entre otras (1). Las moléculas de ubiquitina pueden ser removidas de sus sustratos gracias a la acción de un gran grupo de proteasas, llamadas enzimas deubiquitinizantes (DUBs) (2). Las DUBs son esenciales para la manutención de la homeostasis de la ubiquitina y para la regulación del estado de ubiquitinación de diferentes sustratos. El gran número y la diversidad de DUBs descritas refleja tanto su especificidad como su utilización para regular un amplio espectro de sustratos y vías celulares. Aunque muchas DUBs han sido estudiadas a profundidad, actualmente se desconocen los sustratos y las funciones biológicas de la mayoría de ellas. En este trabajo se investigaron las funciones de las DUBs: USP19, USP4 y UCH-L1. Utilizando varias técnicas de biología molecular y celular se encontró que: i) USP19 es regulada por las ubiquitin ligasas SIAH1 y SIAH2 ii) USP19 es importante para regular HIF-1α, un factor de transcripción clave en la respuesta celular a hipoxia, iii) USP4 interactúa con el proteosoma, iv) La quimera mCherry-UCH-L1 reproduce parcialmente los fenotipos que nuestro grupo ha descrito previamente al usar otros constructos de la misma enzima, y v) UCH-L1 promueve la internalización de la bacteria Yersinia pseudotuberculosis.
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    Effects of 17β-estradiol and tamoxifen on the induction of chromosomal abnormalities and on the expression of her2 gene in breast cancer cell lines
    (2014-07-29) Rondón Lagos, Sandra Milena; Sapino, Anna
    This study covers an area of great importance in the research of breast cancer, related to the study of the effects of both estrogens (E2) and anti-estrogens (Tamoxifen) on chromosomes and of modulation of gene expression. Considering that breast cancer is a very heterogeneous disease and that patients respond differently to treatment, the identification of chromosomal abnormalities as well as genes responsive to 17β-estradiol (E2) and Tamoxifen (TAM) could provide the necessary framework to understand the complex effects of this hormone in target cells and could explain, at least in part, the development of cellular resistance to TAM treatment and the subsequent best therapeutic option. In this order of ideas, we determined the effects of E2 and TAM on the chromosomes and on the modulation of gene expression in four breast cancer cell lines, which represent three of the five subtypes of breast cancer known at present. The results are presented in six chapters - each one has a group of the results achieved around the cytogenetic characteristics and gene expression profiles of four cell lines and the effects of E2 and TAM incubation on those. The first chapter describes the main features of breast cancer, furthering the use and effects of E2 and TAM treatment.
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    The dynamics of local hiv-1 epidemics: the colombian and belgian cohorts
    (2014-08-27) Pineda-Peña, Andrea-Clemencia; Vandamme, Anne-Mieke; Gómez López, Arley; Van Laethem, Kristel; Sussmann, Otto
    We aimed to characterize the HIV-1 epidemic of the Belgian and Colombian cohorts using an integrated approach that includes socio-demographic information, clinical data, and viral sequences, analyzed with statistical and phylogenetic approaches.
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    A "Trojan horse" strategy to reverse drug-resistance in brain tumors
    (2014-07-21) Pinzon-Daza, Martha L.; Riganti, Chiara; Garzón, Ruth
    Los gliomas malignos representan una de las formas más agresivas de los tumores del sistema nervioso central (SNC). De acuerdo con la clasificación de los tumores cerebrales de la Organización Mundial de la Salud (OMS), los astrocitomas han sido categorizados en cuatro grados, determinados por la patología subyacente. Es así como los gliomas malignos (o de alto grado) incluyen el glioma anaplásico (grado III) así como el glioblastoma multiforme (GBM, grado IV),estos últimos los más agresivos con el peor pronóstico (1). El manejo terapéutico de los tumores del SNC se basa en la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia, dependiendo de las características del tumor, el estadio clínico y la edad (2),(3), sin embargo ninguno de los tratamientos estándar es completamente seguro y compatible con una calidad de vida aceptable (3), (4). En general, la quimioterapia es la primera opción en los tumores diseminados, como el glioblastoma invasivo y el meduloblastoma de alto riesgo o con metástasis múltiple, pero el pronóstico en estos pacientes es muy pobre (2),(3). Solamente nuevas terapias dirigidas (2) como las terapias anti-angiogénicas (4); o terapias génicas muestran un beneficio real en grupos limitados de pacientes con defectos moleculares específicos conocidos (4). De este modo, se hace necesario el desarrollo de nuevas terapias farmacológicas para atacar los tumores cerebrales. Frente a las terapias los gliomas malignos son con frecuencia quimioresistentes, y esta resistencia parece depender de al menos dos mecanismos: en primer lugar, la pobre penetración de muchas drogas anticáncer a través de la barrera hematoencefálica (BBB: Blood Brain Barrier), la barrera del fluido sangre-cerebroespinal (BCSFB: Blood-cerebrospinal fluid barrier) y la barrera sangre-tumor (BTB: blood-tumor barrier). Dicha resistencia se debe a la interacción de la droga con varios transportadores o bombas de eflujo de droga ABC (ABC: ATP-binding cassette) que se sobre expresan en las células endoteliales o epiteliales de estas barreras. En segundo lugar, estos transportadores de eflujo de drogas ABC propios de las células tumorales confieren un fenotipo conocido como resistencia a multidrogas (MDR: multidrug resistance), el cual es característico de varios tumores sólidos. Este fenotipo también está presente en los tumores del SNC y su papel en gliomas es objeto de investigación (5). Por consiguiente el suministro de medicamentos a través de la BBB es uno de los problemas vitales en los tratamientos de terapia dirigida. Estudios recientes han demostrado que algunas moléculas pequeñas utilizadas en estas terapias son sustratos de la glicoproteína P (Pgp: P-gycoprotein), así como también de otras bombas de eflujo como las proteínas relacionadas con la resistencia a multidrogas (MRPs: multidrug resistance-related proteins (MRPs) o la proteína relacionada con cáncer de seno (BCRP: breast-cancer resistance related protein)) que no permiten que las drogas de este tipo alcancen el tumor (1). Un sustrato de Pgp y BCRP es la DOXOrubicina (DOXO), un fármaco utilizado en la terapia anti cáncer, el cual es muy eficaz para atacar las células del tumor cerebral in vitro, pero con un uso clínico limitado por la poca entrega a través de la barrera hematoencefálica (BBB) y por la resistencia propia de los tumores. Por otra parte las células de BBB y las células del tumor cerebral tienen también proteínas superficiales, como el receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDLR), que podría utilizarse como blanco terapéutico en BBB y tumores cerebrales. Es asi como la importancia de este estudio se basa en la generación de estrategias terapéuticas que promuevan el paso de las drogas a través de la barrera hematoencefalica y tumoral, y a su vez, se reconozcan mecanismos celulares que induzcan el incremento en la expresión de los transportadores ABC, de manera que puedan ser utilizados como blancos terapéuticos.Este estudio demostró que el uso de una nueva estrategia basada en el “Caballo de Troya”, donde se combina la droga DOXOrubicina, la cual es introducida dentro de un liposoma, salvaguarda la droga de manera que se evita su reconocimiento por parte de los transportadores ABC tanto de la BBB como de las células del tumor. La construcción del liposoma permitió utilizar el receptor LDLR de las células asegurando la entrada a través de la BBB y hacia las células tumorales a través de un proceso de endocitosis. Este mecanismo fue asociado al uso de estatinas o drogas anticolesterol las cuales favorecieron la expresión de LDLR y disminuyeron la actividad de los transportadores ABC por nitración de los mismos, incrementando la eficiencia de nuestro Caballo de Troya. Por consiguiente demostramos que el uso de una nueva estrategia o formulación denominada ApolipoDOXO más el uso de estatinas favorece la administración de fármacos a través de la BBB, venciendo la resistencia del tumor y reduciendo los efectos colaterales dosis dependiente de la DOXOrubicina. Además esta estrategia del "Caballo de Troya", es un nuevo enfoque terapéutico que puede ser considerado como una nueva estrategia para aumentar la eficacia de diferentes fármacos en varios tumores cerebrales y garantiza una alta eficiencia incluso en un medio hipóxico,característico de las células cancerosas, donde la expresión del transportador Pgp se vió aumentada. Teniendo en cuenta la relación entre algunas vías de señalización reconocidas como moduladores de la actividad de Pgp, este estudio presenta no solo la estrategia del Caballo de Troya, sino también otra propuesta terapéutica relacionada con el uso de Temozolomide más DOXOrubicina. Esta estrategia demostró que el temozolomide logra penetrar la BBB por que interviene en la via de señalización de la Wnt/GSK3/β-catenina, la cual modula la expresión del transportador Pgp. Se demostró que el TMZ disminuye la proteína y el mRNA de Wnt3 permitiendo plantear la hipótesis de que la droga al disminuir la transcripción del gen Wnt3 en células de BBB, incrementa la activación de la vía fosforilando la β-catenina y conduciendo a disminuir la β-catenina nuclear y por tanto su unión al promotor del gen mdr1. Con base en los resultados este estudio permitió el reconocimiento de tres mecanismos básicos relacionados con la expresión de los transportadores ABC y asociados a las estrategias empleadas: el primero fue el uso de las estatinas, el cual condujo a la nitración de los transportadores disminuyendo su actividad por la via del factor de transcripción NFκB; el segundo a partir del uso del temozolomide, el cual metila el gen de Wnt3 reduciendo la actividad de la via de señalización de la la β-catenina, disminuyendo la expresión del transportador Pgp. El tercero consistió en la determinación de la relación entre el eje RhoA/RhoA quinasa como un modulador de la via (no canónica) GSK3/β-catenina. Se demostró que la proteína quinasa RhoA promovió la activación de la proteína PTB1, la cual al fosforilar a GSK3 indujo la fosforilación de la β-catenina, lo cual dio lugar a su destrucción por el proteosoma, evitando su unión al promotor del gen mdr1 y por tanto reduciendo su expresión. En conclusión las estrategias propuestas en este trabajo incrementaron la citotoxicidad de las células tumorales al aumentar la permeabilidad no solo de la barrera hematoencefálica, sino también de la propia barrera tumoral. Igualmente, la estrategia del “Caballo de Troya” podría ser útil para la terapia de otras enfermedades asociadas al sistema nervioso central. Por otra parte estos estudios indican que el reconocimiento de mecanismos asociados a la expresión de los transportadores ABC podría constituir una herramienta clave en el desarrollo de nuevas terapias anticáncer.
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    Caracterización y dinámica de los patrones de infecciones únicas y múltiples para seis tipos del virus de papiloma humano de alto riesgo
    (2014-12-03) Soto de León, Sara Cecilia; Patarroyo, Manuel A.; Sánchez Pedraza, Ricardo
    El cáncer de cuello uterino (CCU) es la segunda causa de muerte por cáncer en la población femenina de Colombia con tasas de incidencia y mortalidad altas (32,9-36,4 y 18,7 casos/año/100.000 mujeres, respectivamente). El principal factor de riesgo para el desarrollo de lesiones cervicales pre-neoplásicas es la infección persistente por ciertos tipos de Virus de Papiloma Humano (VPH) conocidos como de alto riesgo (VPH-AR), asociados con ~90% de CCU a nivel mundial. Este trabajo tuvo como objetivo identificar las características de la infección por VPH en una población de mujeres socio-demográficamente heterogénea, que habitan en diferentes regiones de Colombia. Para esto, fueron incluidas 2109 mujeres provenientes de las ciudades de Chaparral, Tumaco, Leticia, Bogotá y Girardot, quienes acudieron a los programas de promoción y prevención de CCU implementados en los respectivos hospitales; cada mujer proporcionó información sociodemográfica y de conductas sexuales, además de una muestra de raspado cervical. Se determinó la presencia de VPH por la técnica de PCR, empleando tres juegos de cebadores genéricos, adicionalmente, se usaron cebadores tipo-específicos para determinar la frecuencia de seis tipos de VPH de alto riesgo (VPH-AR-16, -18, -31, -33, -45 y -58) y dos de bajo riesgo (VPH-BR-6/11). Se evaluó también la carga viral de los tipos de VPH-AR mediante PCR en tiempo real y se correlacionaron los datos de 219 mujeres a través de un seguimiento a dos años (cada 6 meses), con el fin de determinar la dinámica de los patrones de infecciones únicas y múltiples encontrados en nuestro país.
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    Estudio de las modificaciones conformacionales y su influencia en la actividad inmunológica de péptidos derivados de las familias de las proteínas spect-1 y -2, siap-1 y -2 de plasmodium falciparum
    (2015-08-19) Alba Sandoval, Martha; Patarroyo Murillo, Manuel Elkin
    SPECT-1 y -2 y SIAP-1 y -2 son proteínas pertenecientes al esporozoíto de Plasmodium falciparum causante de la malaria más agresiva en los humanos. Estas proteínas están involucradas en el paso del parásito a través de las células del hospedero humano y en la invasión del hepatocito, haciéndolas blancos atractivos para ser estudiadas. Péptidos conservados de alta capacidad de unión (cHABPs) a células HeLa y HepG2 derivados de estas moléculas son no inmunogénicos porque son incapaces de generar una respuesta inmunitaria, pero son claves para el parásito porque cumplen una función importante durante la infección del hospedero humano. En este trabajo se encontró que algunos cHABPs pertenecientes a las proteínas SPECT-1 y -2, están posiblemente involucrados con la unión y formación de poros sobre la membrana de las células hospederas, ayudando al esporozoíto a abrirse paso través de las células del hospedero. Por otro lado, con el fin de cambiar el comportamiento inmunológico de cHABPs derivados de SPECT-1 y -2 y SIAP-1 y -2, se obtuvieron nuevos péptidos mediante el reemplazo de aminoácidos críticos por otros residuos cuya masa molecular sea similar, pero diferente en su polaridad. En este trabajo se reporta que dichas modificaciones promovieron cambios en la estructura secundaria (determinada por DC o 1H-RMN) de los péptidos modificados (mHABPs) cuando se comparó con la estructura de los cHABPs nativos; adicionalmente, estos mHABPs invirtieron su comportamiento inmunológico convirtiéndose en péptidos inmunogénicos inductores de anticuerpos. Lo que permite establecer la existencia de una relación entre la estructura que adoptan estos mHABPs con su actividad inmunológica. Además, algunos de los mHABPs estudiados aquí, pueden ser candidatos a ser incluidos en la vacuna contra la malaria químicamente sintetizada multi-epitope y multi-estadio que se está desarrollando en la Fundación Instituto de Inmunología de Colombia (FIDIC).
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    The use of insect cells to identify potent and selective inhibitors of the replication of the Dengue and Chikungunya viruses and unravel their molecular mechanism of action
    (2015-12-10) Segura Guerrero, Nidya Alexandra; Bello García, Felio Jesús; Neyts, Johan
    Dengue and Chikungunya viruses cause the most important arthropod-borne viral infections for humans. These viruses are predominant in tropical and subtropical regions. In addition, these viruses are predominant in tropical and subtropical regions. Dengue mortality rate is around 1.2 to 3.5% and deaths due to chikungunya fever are around 1 in 1000; however, half of chikungunya-infected patients evolve into a chronic state that can persist for months up to years. There are no antiviral drugs available for DENV and CHIKV treatment and prevention. Moreover, vector control strategies have failed so far. Thus, the development of potent inhibitors for a broad spectrum of RNA viruses is urgently needed. We established and characterized a new embryonic insect cell line from Culex quinquefasciatus mosquito. Also we established the flaviviruses and alphavirus replication, both in C6/36 and Lulo insect cell lines, as well as in Vero cell line. In addition we carried out a reference compound library and reference panel of assays and data for DENV, which provides a benchmark for further studies. During this study, a panel of 9 antiviral molecules, with proven in vitro anti-dengue virus activity and that act at different stages of the DENV life cycle, was selected. Finally, Favipiravir or T-705, was identified as inhibitor in vitro and in vivo of alphaviruses and the mutation K291R in nsP4, which is responsible of the polymerase activity, was found as the mode of action in CHIKV. Interestingly, lysine in motif F1 is also highly conserved in positive-stranded RNA viruses and this might explain the broad spectrum of T-705 antiviral activity.
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    Estudio conformacional de péptidos modificados de las proteínas STARP, CelTOS, TRSP y SERA 5 de Plasmodium falciparum y su relación con una respuesta inmune en malaria
    (2015-07-30) Bermudez, Adriana; Patarroyo Murillo, Manuel Elkin
    El desarrollo de una vacuna contra malaria es un área de exploración activa pero con enormes retos debido especialmente a la complejidad del ciclo del parásito. Así, es necesario bloquear las diferentes etapas de la invasión que tiene el Plasmodium falciparum y extraer de ellas la mayor información posible de la artillería que utiliza para su ataque. Para esto, péptidos de las proteínas STARP, CelTOS y TRSP (del esporozoito) y SERA 5 (del merozoito) que tienen alta afinidad de unión a células HepG2 y a glóbulos rojos respectivamente (conocidos como cHABPs), han sido modificados (conocidos como mHABPs), sintetizados y evaluados a nivel de respuesta inmune en monos Aotus así como estudiados en su conformación estructural por RMN de 1H. Los resultados muestran que los péptidos nativos no son inmunogénicos, pero pueden inducir altos títulos de anticuerpos cuando sus residuos críticos o sus vecinos son reemplazados por otro con un volumen y masa similar, pero diferente polaridad. El estudio conformacional pone de manifiesto que las estructuras de los péptidos nativos son diferentes de sus péptidos modificados ya sea que muestren regiones estructuradas más cortas o más largas o que no presenten ninguna, en comparación con sus análogos modificados altamente inmunogénicos. Las características estereoquímicas particulares en las cadenas laterales de algunos residuos de aminoácidos de estos péptidos modificados así como los rasgos fisicoquímicos parecen jugar un rol importante en la respuesta inmune apropiada cuando estos fueron inmunizados en grupos de monos Aotus confiriendo un avance al diseño de una vacuna contra malaria totalmente eficaz.
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    Genetic Epidemiology of Polyautoimmunity and Common Autoimmunity in Colombia — Proof of Principle
    (2016-11-28) Castiblanco Quinche, John; Anaya, Juan-Manuel
    Introducción: Las enfermedades autoinmunes (EA) son responsables de una gran porción de discapacidad y morbilidad a nivel mundial. Generalmente, las investigaciones científicas se centran en una sola enfermedad, aunque los fenotipos autoinmunes podrían estar representados por efectos pleiotrópicos en genes no-específicos al presentar mecanismos inmunogenéticos similares. Múltiples casos de una sola enfermedad dentro de familia son evidentes, y aún más sorprendente son los individuos en aquellas familias que sufren de múltiples enfermedades autoinmunes. Este estudio exploró la dinámica de agregación familiar y la segregación en pacientes con EA, poliautoimmunidad (polyA) (presentar por lo menos dos AD) y el síndrome autoinmune múltiple (MAS) (presentar tres o más EA). Por otra parte, se examinó el efecto y la importancia de la homocigosis y la ancestría en individuos afectados colombianos con respecto a desarrollar una EA. Métodos: La agregación y segregación familiar se examinó en familiares de primer grado para un rasgo binario en 210 familias afectadas por EA. La homocigosis se estudió en dos enfoques: (I) Comparación de casos y controles mediante la evaluación del efecto de la homocigosis al nivel de todo el genoma en 453 individuos no relacionados (121 EA tardía, 79 EA temprana, 40 polyA, 30 MAS y 183 individuos control); (II) por un estudio de ligamiento no-paramétrico en parientes afectados en 35 familias con MAS, 49 con polyA, 104 con EA tardía, y 83 con EA temprana. La ancestría se examinó en todos los individuos afectados y sanos colombianos, así como individuos originados a partir de poblaciones de referencia, suponiendo tres grupos ancestrales (k = 3) (i.e., europea, amerindia y africana). El efecto de ancestría para los rasgos estudiados se comparó y analizó mediante regresión logística con respecto a los controles. Todos los individuos y las familias fueron tratados e invitados a participar en el Centro de Investigación de Enfermedades Autoinmunes (CREA) en Medellín y Bogotá, Colombia. Resultados: Este proyecto sugiere que las EA no son rasgos independientes y que el género, la edad y la edad de inicio representan factores que definen y permiten el estudio de la dinámica de los rasgos dentro del grupo familiar. Más allá, los datos de segregación proporcionaron soporte para el papel del componente genético en la etiología de las EAs en las familias de aparición tardía, mientras que para las familias de inicio temprano no se observó un papel claro, tal vez debido a la edad relativamente joven familiar. Los datos también mostraron diferencias en la homocigosidad en relación con los controles para las personas de aparición temprana, mientras que en la inspección de varios marcadores locales se sugiere que la homocigosis se encuentra asociada con la protección/susceptibilidad para la EA temprana, de inicio tardío, polyA y MAS. Por otra parte, la ancestría y la autoinmunidad en muestras de colombianos mostraron cómo el paisaje rasgo autoinmune no es un escenario blanco y negro, sino más bien una colorida mezcla de factores genéticos y ambientales. Todos los marcadores analizados fueron muy informativos con una baja frecuencia del alelo nulo haciéndolos óptimos y fiables para estudios de diversidad genética. Conclusiones: Este estudio asumió a la autoinmunidad como un rasgo más que un fenotipo clínico y como un rasgo continuo que presenta fenotipos extremos. Los datos sugieren que las EAs no son independientes. Por último, una EA individual, definida por síntomas y signos, podría no ser completamente yuxtapuesta con una EA definida por el medio ambiente y genética, lo que hace aún más difícil la tarea de definir y dilucidar los mecanismos de las enfermedades.
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    The role of the FKS1 gene in nosocomial Candida albicans isolates’ virulence and antifungal resistance
    (2016-04-12) Rodriguez-Leguizamon, Giovanni; Van Dijck, Patrick; Patarroyo, Manuel A.; Gómez López, Arley
    Candida albicans es el hongo patógeno que con mayor frecuencia compromete a los pacientes en el ambiente hospitalario, su versatilidad para adaptarse al huésped le ha permitido jugar el rol de comensal colonizador de tracto digestivo, tracto genito urinario y la piel entre otras localizaciones anatómicas. Las infecciones causadas por este hongo representan un reto diagnóstico para los médicos frente a sus pacientes y para los sistemas de salud representa un alto costo. El armamentario antifungico se ve reducido ante la capacidad de adaptación de esta levadura dimórfica, convirtiéndose resistente e incrementando el grado de dificultad para lograr un tratamiento exitoso en un paciente crítico. La serie de eventos que permite la adaptación de esta levadura a los ambientes nosocomiales permanecen desconocidas, sin embargo, en el desarrollo de la tesis doctoral se describe el avance en las técnicas micológicas, en la proteomica para el diagnóstico y en la biología molecular, para aportar elementos de criterio diagnóstico y conocer mejor este peligroso patógeno que pone en riesgo la vida de pacientes críticos en los hospitales del mundo. Adicionalmente en el desarrollo de la tesis doctoral se describe el comportamiento fenotípico de una muestra de aislamientos nosocomiales de C.albicans recolectados en instituciones hospitalarias de tercer nivel de atención de Bogotá Colombia, evaluando patrones de susceptibilidad ante las equinocandinas como reciente opción terapéutica, mediante el desarrollo de las pruebas estandarizadas de susceptibilidad del CLSI con las dos últimas versiones M27-A3 y M27-S4, encontrando en esta muestra patrones de susceptibilidad reducidos.
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    Autoantibody and environmental damage to the brain
    (2016-10-24) Arango, María-Teresa; Shoenfeld, Yehuda; Blank, Miri
    Las anormalidades de comportamiento y disfunciones cognitivas pueden presentarse en pacientes con enfermedades autoinmunes. Estos síntomas pueden fluctuar de leves hasta eventos potencialmente mortales. En su gran mayoría los mecanismos responsables de estas manifestaciones neuropsiquiatricas siguen siendo desconocidas, sin embargo se han identificado varias vías patogénicas. Por ejemplo; neurotoxicidad mediada por anticuerpos, vasculopatía inducida por anticuerpos anti-fosfolípidos, neurotoxicidad inducida por citoquinas, así como factores externos que incluyen sustancias tóxicas y medicamentos. Para poder investigar algunos de estos mecanismos, evaluamos el efecto de auto-anticuerpos relacionados con el lupus eritematoso sistémico neuropsiquiátrico en modelos animales (Anticuerpo idiotípico 16/6 y el anticuerpo anti-ribosoma P) y narcolepsia (empleando IgG de pacientes narcolépticos), así como el efecto de la vacuna del virus del papiloma humano en ratones. La inmunización pasiva por inyección intracerebro-ventricular de estos anticuerpos condujo a cambios histológicos, cognitivos y de comportamiento. En particular, los ratones inmunizados con el anticuerpo idiotípico 16/6 desarrollaron déficit cognitivo y los ratones inmunizados con el anticuerpo anti-ribosomal P desarrollaron depresión. Los ratones que recibieron IgG total de pacientes narcolépticos desarrollaron trastornos del sueño y cambios histológicos cerebrales consistentes con la enfermedad. Un análisis más profundo del papel del anticuerpo anti-ribosomal P humano reveló que reacciona de manera cruzada con la proteína neuronal “Gap43” interfiriendo con procesos celulares. Por otra parte, la inmunización con la vacuna del virus del papiloma humano causó la producción de anticuerpos contra componentes del cerebro. Adicionalmente, los ratones inmunizados con la vacuna, al igual que los inmunizados con su adyuvante desarrollaron deficiencia cognitiva y conductual, que fue mejorada con la suplementación alimenticia basada en fosfolípidos. En general, aquí se demuestra que anormalidades del comportamiento y disfunciones cognitiva pueden ser parte de la amplia gama de manifestaciones clínicas autoinmunes. Además, nuestros resultados sugieren que estas pueden ser causadas por daños colaterales debido a la desregulación inmune causada por autoinmunidad, así como por la vacunación. Adicionalmente, sugerimos que diferentes auto-anticuerpos causan diferentes síntomas basados en diferentes interacciones con el tejido cerebral.
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    Disección molecular de la etiología de la falla ovárica prematura por secuenciación directa y NGS: estudio de la implicación de los genes CITED2, CDKN1B, FOXO4, BMP15 y ADAMTS19
    (2016-05-13) Fonseca Mendoza, Dora Janeth; Laissue, Paul
    Entre las causas femeninas de infertilidad, la Falla Ovárica Prematura (FOP) es frecuente, ya que afecta al 1% de las mujeres menores de 40 años de edad (Coulam et al, 1986). La FOP se define clínicamente por amenorrea de más de 6 meses de duración, niveles plasmáticos elevados de gonadotrofinas y deficiencia de esteroides sexuales antes de los 40 años de edad. La FOP puede ocurrir por una variedad de mecanismos que conducen a la disminución del número de folículos, al incremento de la atresia folicular o a la falla en la maduración de los folículos (Beck-Peccoz et al, 2006). La FOP se ha asociado a varias etiologías, pero en más del 80% de los casos, no se conoce la causa de la enfermedad. Esta alta prevalencia de casos idiopáticos sugiere la implicación de factores genéticos y ambientales (Maclaran et al, 2011). La complejidad de los procesos fisiológicos, celulares y genéticos subyacentes a la determinación sexual, la foliculogénesis y la ovulación sugiere la participación de numerosos genes regulados de una manera precisa en cada etapa del desarrollo (Laissue, 2015). En este contexto, es fundamental integrar el alcance de las distintas técnicas para la búsqueda de factores genéticos etiológicos de la FOP. En efecto, tanto la secuenciación directa como las aproximaciones multigénicas para el análisis genómico a gran escala son aproximaciones complementarias para este ejercicio. La iniciativa principal de este trabajo doctoral consistió en realizar aproximaciones monogénicas (secuenciación de Sanger) y multigénicas Next generation sequencing (NGS) para la identificación de nuevos genes asociados a FOP. La identificación de nuevos genes y de variantes potencialmente deletéreas, así como su validación a través de estudios funcionales y análisis poblacionales, permitió aportar nuevo conocimiento en la etiología molecular de la FOP
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    Next-generation sequencing and genome analysis in dimorphic fungi and human: using genomic variation to recognize and understand disease
    (2017-08-29) Gallo Bonilla, Juan Esteban; Clay, Oliver
    The work of this thesis has a common focus on bioinformatics, comparative genomics of fungal genomes and clinical genomics of human chronic disease. We primarily focused on using genomic data of dimorphic fungal pathogens in order to obtain a better perspective and understanding of how commonly used assembly, annotation and genomic comparison bioinformatics programs dealt with genomic data. Our group re-sequenced the reference strains that had been used for the existing assemblies and annotations of Paracoccidioides spp., and used the new, higher quality reads to substantially improve the reference assemblies and annotations of these pathogenic fungi. We also sequenced de novo the species Emmonsia crescens and E. parva, which are closely related to the causal agent of blastomycosis, Blastomyces dermatitidis, but non-pathogenic or with low virulence. We performed comparative analyses of gene content and structure between various strains of B. dermatitidis, E. crescens and E. parva. Using available sequences, we then designed and analytically validated two primer pairs from regions that are unique to Histoplasma capsulatum but present across diverse strains of this species, and can therefore be utilized to detect the presence of H. capsulatum. Using the same approach, we also designed and analytically validated three primer pairs of high confidence for the amplification of sequence fragments that are unique to the genus Paracoccidioides. We designed and implemented an algorithm that takes any given sequence(s) and splits the sequence into fragments in order to query the unique percentage of the fragment against a group of sequences that are closely related to the query as well as outgroups that may be relevant in clinical settings, including human. we genotyped 67 selected SNPs within the 9p21.3 locus of the human genome, motivated by its proven association with cardiovascular disease, for a Colombian cohort of 357 healthy individuals with data collected for detailed hemodynamic and other phenotypic traits. We also sequenced the exome of a patient with familiar hypercholesterolemia.
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    The effector of hedgehog signaling, the transcription factor GLI1: novel regulatory mechanisms and role in tamoxifen treatment
    (2017-01-30) Villegas Gálvez, Victoria Eugenia; Zaphiropoulos, Peter; Ramírez Clavijo, Sandra Rocío
    In Chapter I, we describe the characterization of an RNA transcript from the antisense strand of the GLI1 gene, termed GLI1AS, with no potential to code for a long protein, which acts as a negative regulator of GLI1 expression. We provide evidence for capping and polyadenylation of this antisense RNA, suggesting that it is processed similarly to a typical mRNA, even though it lacks the potential to code a protein. Additionally, our data show that GLI1 mRNA expression is higher than GLI1AS across all samples examined, consistent with the results reported for most antisense transcripts with regulatory roles on the corresponding sense gene. Chromatin immunoprecipitation assays supported the notion that GLI1AS acts as an epigenetic modifier, which elicits negative feedback on GLI1 expression via local chromatin remodeling, observations that were in-line with cellular proliferation and chick chorioallantoic membrane (CAM) tumor assays. In Chapter 2, we present in vitro data using a number of different breast cancer cell lines, demonstrating the modulatory effect of tamoxifen (TAM) on cellular proliferation and expression of HH signaling components, in particular GLI1. Our results show that cell lines that express nuclear GLI1 staining after TAM treatment exhibit an increase in cell proliferation compared to control, GLI1 negative cells. These findings could indicate that the HH signaling pathway can be activated by TAM in breast cancer cells, eliciting cellular growth.
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    Caracterización del complejo mayor de histocompatibilidad clase II en primates del género Aotus
    (2017-10-05) Suarez Martinez, Carlos Fernando; Cadavid Gutiérrez, Luis Fernando; Patarroyo, Manuel A.
    El presente trabajo tiene como propósito contribuir al conocimiento del complejo mayor de histocompatibilidad clase II (CMH-II) de los monos Aotus, contribuyendo a la validación de este primate como modelo experimental, y aumentando el conocimiento en la evolución de los genes del CMH en primates. Además, se profundizó en el análisis de convergencia y polimorfismo de los genes del CMH-DR en primates. Se implementaron metodologías de modelación computacional de la unión CMH-péptido, como herramientas necesarias para entender los mecanismos de presentación de péptidos por parte del CMH clase II a los linfocitos T. El estudio del polimorfismo de la región de unión al péptido, permitió el desarrollo de estrategias para reducir eficientemente el número de sistemas a considerar en el diseño de péptidos a ser usados como candidatos a vacuna contra la malaria. Usando minería de datos sobre distribuciones de Ramachandran, se desarrolló una escala de similitud estructural de aminoácidos, con el fin de implementar su uso en el desarrollo de péptidos candidatos a vacunas. Adicionalmente, se encontró que la estructura secundaria de las proteínas tiene una relación clara con los patrones evolutivos de sustitución y la mutabilidad de los aminoácidos. Así, se ha generado un marco de conceptual que contribuye al desarrollo de vacunas basadas en péptidos, que tiene como base el estudio del polimorfismo del complejo mayor de histocompatibilidad, las restricciones fisicoquímicas/estructurales que moldean el proceso de reconocimiento molecular involucrado en la interacción CMH-péptido y la aplicación de metodologías computacionales para cuantificar el proceso de unión CMH-péptido.
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    Estudio de interacciones hospedero-patógeno y proteína-proteína en Plasmodium Vivax : evaluación de las proteínas del cuello de optrias -2, -4 y -5 y del antígeno apical de membrana-1
    (2018-04-16) Arévalo-Pinzón, Gabriela; Patarroyo, Manuel A.; Fuentes García, Manuel; Fernández-Soto, Pedro
    La malaria es una de las enfermedades tropicales transmitidas por vectores más importantes a nivel mundial, donde Plasmodium vivax representa una de las especies más ampliamente distribuidas, afectando ~13.8 millones de personas por año. Pese a ello, el progreso aparentemente lento de la infección y los niveles bajos de parasitemia en el humano, comparados a lo reportado en Plasmodium falciparum, han llevado a clasificar a la infección por P. vivax erróneamente como benigna. Esto, sumado a los retos experimentales que trae consigo el cultivo de este parásito, obstaculizan en gran medida el conocimiento a nivel biológico, celular y molecular, necesario para el desarrollo de métodos de control efectivos contra P. vivax. Hoy en día, se conoce que un inadecuado diagnóstico, el mal manejo terapéutico y/o el retraso en el tratamiento, pueden llevar a recaídas y estados de enfermedad grave, similares a los reportados para la malaria producida por P. falciparum, lo que impone retos en la búsqueda de nuevas alternativas específicas contra esta especie. Teniendo en cuenta la necesidad de identificar posibles blancos terapéuticos contra P. vivax, este trabajo se enfocó en estudiar interacciones del tipo receptor-ligando y proteína-proteína de moléculas de P. vivax localizadas en los organelos apicales de esquizontes intraeritrocíticos. Basados en estudios previos en P. falciparum y Toxoplasma gondii, donde se describe la importancia funcional de las proteínas localizadas en el cuello de las roptrias (RONs) -2, -4 y 5 y del antígeno apical de membrana 1 (AMA1), se caracterizó en P. vivax la unión de cada una de estas proteínas con reticulocitos humanos y se evaluó la capacidad de PvRON2 para establecer interacciones con las proteínas PvRON4, PvRON5 y PvAMA1. Para esto, inicialmente se caracterizó mediante herramientas bioinformáticas y experimentales la presencia de los genes pvron4 y pvron5 en el genoma y transcriptoma de esquizontes de la cepa Vivax Colombia Guaviare 1 (VCG-1) de P. vivax. Estos dos genes codifican proteínas de alto peso molecular que se expresan en el polo apical de esquizontes y co-localizan con proteínas presentes en las roptrias. Para evaluar la capacidad de interacción de las proteínas PvRON2, PvRON4, PvRON5 y PvAMA1 con receptores sobre la membrana de reticulocitos humanos, todas ellas fueron producidas de forma recombinante y purificadas mediante cromatografía de afinidad. Se encontró que la proteína recombinante PvRON5 se unió tanto a normocitos como a reticulocitos CD71+, con una marcada preferencia por reticulocitos humanos. Por su parte, las proteínas recombinantes que incluyen los dominios I y II de PvAMA-1 (PvAMA-DI-DII), la región central de la proteína PvRON2 (PvRON2-RI) y la región carboxi-terminal de PvRON4, interactúan específicamente con reticulocitos CD71+CD45-. Los estudios de competencia de unión con péptidos sintéticos que cubren las secuencias de las proteínas recombinantes mostraron que los péptidos 21270 (derivado del DI de PvAMA1), 40305 (de PvRON4) y 40595 (de PvRON2-RI) fueron capaces de inhibir la unión de las proteínas recombinantes a reticulocitos CD71+CD45-, lo que sugiere que estas secuencias peptídicas contienen parte de las propiedades de unión de cada una de las proteínas de las que derivan. Los tres péptidos se unen específicamente y con alta afinidad a eritrocitos con porcentajes de unión mayores al 2% (obtenidas de las curvas de unión específica), permitiendo catalogarlos como péptidos con alta capacidad de unión a eritrocitos (HABPs, del inglés High Activity Binding Peptides). La unión de las proteínas PvAMA1 y PvRON4 a eritrocitos humanos fue sensible al tratamiento de los eritrocitos con diferentes enzimas (tripsina, quimotripsina y/o neuraminidasa), sugiriendo que la naturaleza de los receptores para estas proteínas es de tipo proteico. Estos resultados destacan la función de adhesina de las proteínas evaluadas y revelan las regiones mínimas de interacción con la célula hospedera, que sumado a la expresión de estas proteínas en esquizontes intraeritrocíticos y su localización en organelos apicales, sugieren una fuerte participación de estas moléculas durante el proceso de invasión de los merozoitos de P. vivax a reticulocitos humanos. Finalmente, mediante resonancia de plasmones de superficie, se caracterizaron las interacciones entre la proteína PvRON2 con las proteínas PvRON4, PvRON5 y PvAMA1. Los análisis revelaron que la región carboxi-terminal de la proteína PvRON2 (PvRON2-RII) y PvRON2-RI interactúan específicamente y con alta afinidad con el dominio II y III de PvAMA1 (PvAMA-DII-DIII) y con una menor afinidad con las proteínas PvAMA-DI-DII, PvRON4 y PvRON5. Al modificar algunos residuos de la proteína PvAMA1, reportados en P. falciparum como críticos en la interacción RON2-AMA1, no se encontraron diferencias importantes en los valores de las velocidades de asociación (Kon), disociación (Koff) y en la constante de disociación de la interacción (kD). Esto sugiere que, si bien existen interacciones proteína-proteína (IPP) conservadas entre estos parásitos (Pv-Pf), cada parásito utiliza distintas regiones de las proteínas para interactuar, lo que resalta su capacidad para especializarse o restringirse para invadir un tipo de célula específica y pone de manifiesto aún más la necesidad de diseñar medidas de control específicas contra P. vivax.
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    Identificación y validación funcional de nuevos genes y mutaciones asociadas a la etiología de la insuficiencia ovárica primaria (IOP) : implicación de los genes BMP15, BMPR2, MSH4, ATG7, ATG9A y NOTCH2
    (2018-07-26) Patiño Molano, Liliana Catherine; Laissue, Paul
    La insuficiencia ovárica primaria (IOP) es una patología frecuente que afecta del 1% al 3% de las mujeres de la población general menores de 40 años. No existen datos específicos en la población colombiana, lo cual sería un punto importante a determinar teniendo en cuenta que se ha reportado que esta prevalencia puede variar según el origen étnico de las pacientes. La IOP se caracteriza clínicamente por la ausencia (amenorrea primaria) o el cese de la ovulación durante al menos cuatro meses (amenorrea secundaria), con un aumento de los valores plasmáticos de FSH (hormona folículo estimulante). Aunque se han relacionado causas autoinmunes, metabólicas, infecciosas e iatrogénicas, en la mayoría de los casos su etiología es desconocida, lo que sugiere posibles causas genéticas. A pesar de numerosos intentos por determinar estas causas, solo algunos genes han sido relacionados funcionalmente con la etiología de esta enfermedad. En esta tesis de Doctorado se realizó la identificación y la validación de nuevas variantes y/o nuevos genes asociados a la etiología de la IOP. Este trabajo de tesis se divide en dos capítulos, en el primero se describe la identificación de variantes en el gen BMP15 y la evaluación de cómo las mutaciones en este gen contribuyen a la disfunción ovárica. Para esto se evaluó el efecto de 10 mutaciones en BMP15 respecto a la producción del péptido maduro, la activación de la señalización de la vía SMAD y la sinergia con GDF9. La genotipificación de BMP15 en 35 pacientes Colombianas permitió la identificación de una variante nueva (c.986C>G-p.Arg329His) y una variante previamente reportada (c.581T>C, p.Phe194Ser). La evaluación funcional de estas variantes, junto con otras 8 identificadas previamente, indicó que las mutaciones p.Leu148Phe, p.Phe194Ser y p.Tyr235Cys, están relacionadas con la reducción en la producción del péptido maduro. Las mutaciones p.Arg138His, p.Ala180Thr y p.Arg329His redujeron la actividad de BMP15 aproximadamente cuatro veces en relación con la proteína WT (wild type) y las variantes p.Arg68Trp, p.Phe194Ser y p.Asn196Lys redujeron la sinergia de BMP15 con GDF9. Estos resultados sugieren que las mutaciones en BMP15 alteran la función ovárica por diferentes mecanismos. El segundo capítulo se focaliza en la identificación de mutaciones con un efecto moderado/severo que puedan estar potencialmente relacionadas con la etiología de la IOP mediante NGS (secuenciación de siguiente generación). Se tuvieron en cuenta tres aproximaciones: la primera consistió en el diseño de un subset de genes candidatos para la secuenciación específica de la región codificante de 70 genes, la segunda se centró en la secuenciación de exoma en una familia afectada por IOP y la tercera se enfocó en la secuenciación de exoma en pacientes no relacionados (casos no familiares). Estas aproximaciones permitieron la identificación de aproximadamente 60 variantes posiblemente relacionadas con la etiología de la IOP. Adicionalmente, se encontró que algunas pacientes eran portadoras de al menos dos variantes en diferentes genes, este hallazgo refuerza la hipótesis sobre la etiología poligénica de esta enfermedad. Finalmente, se describe la validación funcional de algunas de las mutaciones identificadas. Estos ensayos experimentales in vitro permitieron confirmar que las mutaciones en los genes: BMPR2 (c.2960C>T-p.Ser987Phe), MSH4 (c.2355+1G>A-p.Ile743_Arg785del), ATG7 (c.1209T>A-p.Phe403Leu), ATG9A (c.2272C>T-p.Arg758Cys) y NOTCH2 (c.5411C>T-p.Ser1804L, c.6947>T-p.Ala2316Val y c.7075C>G-p.Pro2359A) modifican la función cada una de las proteínas WT (wild type). sugiriendo una contribución a la etiología de la IOP. La identificación de nuevos genes y de variantes potencialmente deletéreas, así como su validación a través de estudios funcionales, permitió aportar nuevo conocimiento en la etiología molecular de la IOP. Estos hallazgos pueden ser utilizados para propósitos diagnósticos y/o pronósticos de la enfermedad.
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    New molecular approches using AR, FOXA1 and HER2 for outcome classification of estrogen Receptor-Positive (ER+) breast cancers”
    (2018-06-06) Rangel Jiménez, Nelson Enrique; Sapino, Anna; Ramírez Clavijo, Sandra Rocío
    Here, we studied new prognostic and predictive easy access strategies in breast cancer (molecular markers), for better classify ER+ breast cancer disease, which might provide additional information and be complementary to the clasical clinical-pathological prediction models.
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    Genómica funcional y disección molecular de FOXD1 para la identificación de nuevos biomarcadores genéticos asociados a patologías de la reproducción de origen endometrial y placentario
    (2018-12-03) Quintero Ronderos, Paula Juliana; Laissue, Paul
    El aborto espontáneo recurrente (AER) se define como dos o más pérdidas consecutivas de la gestación antes de la semana 20 del desarrollo intrauterino. Esta patología afecta a aproximadamente entre el 1% y el 5% de las parejas. La etiología del AER se puede dividir en causas no-genéticas como genéticas. Sin embargo, ~50% de los casos se considera idiopático. De manera análoga, la etiología molecular de la falla de implantación recurrente (FIR), definida como la falla de la implantación en al menos 2 o más ciclos consecutivos de fertilización in vitro, es poco conocida. La etiología molecular del AER y de la FIR está asociada potencialmente a variantes de secuencia en cientos de genes candidato que participan en las cascadas moleculares fisiológicas de la implantación y durante toda la gestación. La aproximación gen candidato, usando la secuenciación de Sanger, ha sido de utilidad para la descripción de pocos genes implicados en el AER. La secuenciación de siguiente generación (NGS) ha sido una herramienta eficiente puesto que permite el estudio simultáneo de múltiples genes relacionados con enfermedades complejas. En la primera parte de este trabajo de tesis se utilizó la aproximación NGS-exoma para identificar nuevos genes y mutaciones potencialmente implicadas en el desarrollo del AER. Algunas de las mutaciones encontradas por este abordaje fueron estudiadas mediante ensayos funcionales in vitro para determinar su posible efecto deletéreo. La identificación de la variante THBD p.Trp153Gly en mujeres colombianas con AER y su validación mediante ensayos funcionales in vitro sugiere, por primera vez, una relación directa entre formas mutantes de esta proteína y la fisiopatología del AER, considerándose como un posible marcador molecular para el diagnóstico en pacientes colombianas con AER idiopático. En la segunda parte del presente trabajo de tesis identificamos y estudiamos funcionalmente nuevas mutaciones de FOXD1, un gen relevante en la fisiología endometrial y placentaria, identificadas en pacientes FIR, AER, preeclampsia (PE) y retardo del crecimiento intrauterino (RCIU). Los ensayos funcionales in vitro demostraron que las mutaciones FOXD1-p.His267Tyr y FOXD1-p.Arg57del. modifican la transactivación del promotor de C3, contribuyendo con el fenotipo. FOXD1 podría considerarse en consecuencia un marcador molecular diagnóstico para las pacientes con AER, FIR, RCIU y PE. Por último, ensayos por inmunoprecipitación de la cromatina secuenciación NGS (ChIP-seq) permitieron determinar potenciales nuevos genes blanco directos de FOXD1 (CTSC, CD86, CMA1 y TRPC6) en un contexto placentario. La información generada durante este trabajo de tesis aporta al conocimiento sobre el origen genético del AER, la FIR, y el RCIU/PE. Estos resultados podrían ser de utilidad para los especialistas clínicos en el contexto del desarrollo de la medicina traslacional.
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    Identification of transcriptomic responses related to normal, healthy and accelerated aging
    (2018-12-14) Payan-Gomez, Cesar; Ramírez Clavijo, Sandra Rocío
    El envejecimiento es la reducción de las capacidades fisiológicas y adaptativas del organismo con el paso del tiempo. La acumulación de daño en el ADN podría ser el evento central desencadenante del proceso de envejecimiento. Los síndromes progeroides causados por una deficiencia de la sub-vía de reparación de escisión de nucleótidos acoplada a transcripción (TCR-NER) presentan un vínculo directo entre daño en el ADN y envejecimiento. Hay un paralelo entre la respuesta transcripcional de ratones progeroides y ratones sometidos a restricción dietética (DR) (una intervención que prolonga la vida). La DR aumenta la resistencia a diferentes formas de estrés. Ratones deficientes en TCR-NER también son menos susceptibles a un tipo de estrés agudo. El paralelo entre las respuestas transcriptómicas de los animales en dos extremos de esperanza de vida se ha explicado por la existencia de una respuesta de supervivencia programada. Esta tesis aborda varias cuestiones relacionadas con la respuesta de supervivencia utilizando principalmente el análisis de datos transcriptómicos. Primero, se estableció que los ratones viejos activan una respuesta de supervivencia incompleta después de tres días de DR, en segundo lugar, se describió un mecanismo común de activación de la respuesta protectora. En tercer lugar, se proporcionó una conexión entre la acumulación de daño en el ADN y la neurodegeneración. Finalmente, por medio de una metodología de análisis integrador sobre datos de transcriptómica de cerebro humano se encontró que en envejecimiento normal los astrocitos desarrollan dos fenotipos opuestos.